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高效液相色譜儀的操作步驟及注意事項(xiàng)
液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC）及液-固色譜(LSC）�，F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、信號(hào)記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點(diǎn)。下面是小編整理的高效液相色譜儀的操作步驟及注意事項(xiàng)，一起來看看吧。
一、操作步驟：
1.開機(jī)前先將流動(dòng)相過濾和超聲：水流動(dòng)相用混合濾膜（0.2μm）過濾,有機(jī)流動(dòng)相用有機(jī)濾膜過濾，之后超聲脫氣15-20分鐘。（過濾的目的是除去流動(dòng)相里的雜質(zhì)，以免雜質(zhì)進(jìn)入色譜柱堵塞色譜柱；超聲的目的是排除流動(dòng)相里面的氣體，以防氣體進(jìn)入色譜柱損害色譜柱，影響柱效能）
注：試驗(yàn)過程中由于只有0.45μm的混合濾膜，第一次使用時(shí)感覺效果不好，于是過濾水時(shí)同時(shí)使用兩張混合濾膜過濾水流動(dòng)相。
2.超聲結(jié)束后，將流動(dòng)相放置到規(guī)定位置（1號(hào)泵接水流動(dòng)相，2號(hào)泵接有機(jī)流動(dòng)相），開機(jī)逐個(gè)排氣（先啟動(dòng)泵，排氣結(jié)束后再打開檢測(cè)器）。
3.排氣結(jié)束后，關(guān)閉所有排氣閥。先用純有機(jī)流動(dòng)相沖洗色譜柱20-30分鐘，基線走穩(wěn)之后，再打開水流動(dòng)相（注意：水流動(dòng)相和有機(jī)流動(dòng)相流速之和為1ml/min），繼續(xù)走基線，直到基線平穩(wěn)。
注意：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，再用純有機(jī)流動(dòng)相沖洗色譜柱20-30分鐘，沖出色譜柱內(nèi)殘留的樣品物質(zhì)，預(yù)防長(zhǎng)時(shí)間不使用儀器樣品的殘留物質(zhì)沉積在色譜柱內(nèi)，導(dǎo)致下次使用難以沖出，色譜柱柱壓偏高，基線不穩(wěn)，出現(xiàn)大量鬼峰。（不同規(guī)格的色譜柱其所允許的最大流速之和不同）
4.走基線時(shí)，應(yīng)將進(jìn)樣閥處于Load狀態(tài)，用注射器進(jìn)樣時(shí)應(yīng)快速進(jìn)樣，進(jìn)樣后將進(jìn)樣閥立即扳回到Inject狀態(tài)，此時(shí)液相系統(tǒng)開始進(jìn)入采樣狀態(tài)。采樣結(jié)束后，可在數(shù)據(jù)分析里面查看分析結(jié)果并可進(jìn)行編輯，也可以在脫機(jī)狀態(tài)下查看樣品的分析結(jié)果并編輯。
二、使用中常見的問題及注意事項(xiàng)
1.過濾時(shí)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)流動(dòng)相漏液�？赡艿脑蚴菫V膜放置不正確（有點(diǎn)偏）和接頭有點(diǎn)錯(cuò)位，導(dǎo)致流動(dòng)相從縫隙中漏出。
注意：操作時(shí)，應(yīng)先向?yàn)V瓶?jī)?nèi)倒入少量流動(dòng)相，觀察是否漏液并開始過濾，若未漏液，再向?yàn)V瓶中添加流動(dòng)相。
2.超聲時(shí)，瓶外液體的液面應(yīng)高于瓶?jī)?nèi)流動(dòng)相的液面，否則流動(dòng)相內(nèi)的氣體可能無法排出液體，氣體仍然殘留在流動(dòng)相內(nèi)，以致開機(jī)排氣時(shí)無氣泡排出。
3.開機(jī)排氣結(jié)束后，應(yīng)先將流動(dòng)相流量調(diào)小，再關(guān)閉排氣閥，否則會(huì)導(dǎo)致柱壓瞬間升高超過壓力上限，致使泵停止工作。
4.反相高效液相色譜儀沖洗柱子時(shí)，應(yīng)盡量避免使用純水流動(dòng)相沖洗柱子，因?yàn)樗畼O性強(qiáng)，會(huì)損害色譜柱（反相高效液相色譜儀的色譜柱C18是非極性的），導(dǎo)致柱效下降。
5.沖洗色譜柱時(shí)，還可輔助以不同比例的混合流動(dòng)相沖洗色譜柱，以沖出不同極性的殘留物質(zhì)，但最后還是要用純有機(jī)流動(dòng)相沖洗色譜柱一段時(shí)間。
6.在實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)出現(xiàn)壓力超過上限或壓力偏高（在壓力上限范圍內(nèi)有機(jī)流動(dòng)相和水流動(dòng)相流速之和無法達(dá)到1ml/min），有可能是柱內(nèi)有殘留物質(zhì)未被沖出，此時(shí)應(yīng)用較大流速（≤1ml/min）的有機(jī)流動(dòng)相充分沖洗色譜柱。若條件允許，也可采用梯度洗脫的方式?jīng)_洗色譜柱。壓力過高也有可能是濾頭堵塞，此時(shí)可將濾頭取出放到有機(jī)溶劑中超聲。
7.若隔天或更長(zhǎng)時(shí)間不使用液相色譜儀，應(yīng)將兩流動(dòng)相瓶中均倒入純的有機(jī)流動(dòng)相（因?yàn)樗鲃?dòng)相長(zhǎng)時(shí)間不用會(huì)滋生細(xì)菌，污染濾頭和色譜柱，導(dǎo)致下次開機(jī)使用時(shí)會(huì)出現(xiàn)鬼峰，基線不穩(wěn)）。
8.進(jìn)樣時(shí)所進(jìn)樣品的體積應(yīng)不小于色譜柱的最大容積，且進(jìn)樣時(shí)注射器里的氣泡一定要排出，不可將氣泡打進(jìn)色譜柱。
工作原理
系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱（固定相）內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
進(jìn)樣系統(tǒng)
一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
輸液系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l．47～4．4X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。
分離系統(tǒng)
該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm（需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）．固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達(dá)1000?）和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等）或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。基質(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。
再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
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