食品中細(xì)菌總數(shù)的檢驗實(shí)驗步驟及注意事項

　　一、實(shí)驗?zāi)康囊��?/strong>

　　1、了解細(xì)菌總數(shù)檢驗的意義。

　　2、掌握樣品稀釋處理的方法和菌落總數(shù)計數(shù)的方法3、掌握國標(biāo)法測定菌落總數(shù)的方法和技能4、熟練無菌操作技術(shù)。

　　二、原理

　　菌落總數(shù)是指食品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所含細(xì)菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。

　　菌落總數(shù)并不表示樣品中實(shí)際存在的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

　　三、試劑和儀器

　�。ㄒ唬┳钕葴�(zhǔn)備的器材（清洗、烘干、包扎、滅菌）

　　規(guī)格名稱

　　1、500ml廣口瓶2、500ml三角瓶3、250ml三角瓶4、18×180mm試管數(shù)量1個1個2個3支

　　用途:稀釋樣品

　　配制:生理鹽水

　　配制:營養(yǎng)瓊脂稀釋樣品倒?fàn)I養(yǎng)平板

　　5、1ml移液管5支

　　6、直徑為90mm平皿10套

　　7、250ml量筒1支

　　8、玻璃珠：直徑約5mm

　�。ǘ�）應(yīng)滅菌、消毒的器材

　　剪刀1把不銹鋼藥匙1把稱量紙：適量酒精消毒的器材：吸耳球1個，滴管膠頭4只，開瓶器

　�。ㄈ�）應(yīng)制備的培養(yǎng)基

　　培養(yǎng)基總量所用容器

　　1、0.85%NaCl生理鹽水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶2、平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶四、實(shí)驗內(nèi)容

　　（一）、基本操作過程：

　　樣品稱量→→樣品稀釋→→傾注平皿→→培養(yǎng)48小時→→計數(shù)報告。（二）、樣品的稀釋（樣品的處理）

　　樣品：袋裝乳粉

　　外包裝消毒→→無菌稱樣品25g→→加無菌生理鹽水→→加蓋振蕩搖均勻

　　1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用無菌剪刀開封取樣。稱取檢樣25g，放入裝有適量玻璃珠的滅菌廣口瓶子中，然后用225mL溫?zé)岬臏缇�生理鹽水徐徐加入（先加入少量生理鹽水將乳粉調(diào)成糊狀，再全部加入，以免奶粉結(jié)團(tuán)），采用振搖法（用力快速振搖50次,振幅不小于40cm）振搖均勻，即為1:10的稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。

　　2、用1ml滅菌吸管，吸取1∶10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1∶100稀釋液。

　　3、另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管。

　　4、根據(jù)對檢樣污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的稀釋液1ml于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2個平皿。

　　5、用1ml生理鹽水作空白對照試驗，做2個平皿。?注意：

　�、傥�管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內(nèi)稀釋液。

　�、谖�管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時，插入深度要達(dá)2.5cm以上,調(diào)整時應(yīng)使管尖與容器內(nèi)壁緊貼。

　�、圻M(jìn)行稀釋時，應(yīng)使吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。

　�、苊窟f增稀釋一次，即換用一支1ml滅菌吸管。（三）、倒平板

　　稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至46℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（放置于46℃水浴保溫）傾注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。

　　注意：

　�、倥囵B(yǎng)基不能觸及平皿口邊沿，加入培養(yǎng)基后可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，但不可用力過度，以免濺起觸及上蓋。

　�、跈z樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿，所用時間不宜超過20min。

　�。ㄋ模�、培養(yǎng)

　　待瓊膠凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h后取出，立即計算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。

　　注意：

　　（1）瓊脂凝固后，就立即將平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以免細(xì)菌蔓延生長。

　　（2）

　　如果把不能立即計數(shù)，要將平板放入0～4℃冰箱中，但不能超過24h。

　　不同產(chǎn)品菌落總數(shù)測定的培養(yǎng)時間：

　　肉、乳、蛋及制品：37℃培養(yǎng)48h水產(chǎn)品：30℃培養(yǎng)48h：清涼飲料、調(diào)味品、糕點(diǎn)、果脯、酒類等：37℃培養(yǎng)24h五、結(jié)果報告

　　1、平皿菌落數(shù)的選擇

　�。�1）選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。每一個稀釋度應(yīng)采用兩個平皿，大于300的可記為多不可計。

　�。�2）其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計算半個平板后乘以2，以代表一個平板的菌落數(shù)。

　�。�3）當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。2、菌落總數(shù)的計算

　�。�1）若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。

　�。�2）若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按如下公式計算：N=∑C/（n1+0.1n2）d…………（1)式中：N―樣品中菌落數(shù)；∑C―平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；nl―第一個適宜稀釋度平板數(shù)；n2―第二個適宜稀釋度平板數(shù)；d―稀釋因子（第一稀釋度）。

　�。�3）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均>300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

　�。�4）若所有稀釋度平板菌落數(shù)均<30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)計算。（5）若所有稀釋度平板均無菌落生長，則應(yīng)按<1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。

　　（6）若所有稀釋度均不在30～300之間，有的>300，有的又<30，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

　　3、報告方法

　�。�1）菌落數(shù)在1～100時，按四舍五入報告兩位有效數(shù)字。

　　（2）菌落數(shù)≥100時，第三位數(shù)字按四舍五入計算，取前面兩位有效數(shù)字，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可以10的指數(shù)表示。

　�。�3）若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。

　�。�4）若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。

　�。�5）稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。

　　四、實(shí)驗內(nèi)容

　�。ㄒ唬�、基本操作過程：

　　樣品稱量→→樣品的稀釋→→傾注平皿→→培養(yǎng)5天→→計數(shù)報告。（二）、樣品的稀釋（樣品的處理）

　　樣品：糖果

　　用滅菌鑷子夾取包裝紙,稱取數(shù)塊共25g，加入預(yù)溫至45℃的滅菌水225mL，待溶化后檢驗。

　　1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，以無菌操作開封取樣。稱取檢樣25g，放入裝有適量玻璃珠的滅菌廣口瓶子中。然后加入225mL的滅菌水，采用振搖法（用力快速振搖50次,振幅不小于40cm）振搖30min，振搖均勻，即為1:10的稀釋液。

　　2、用10ml滅菌吸管，吸取1∶10稀釋液10ml，注入無菌試管內(nèi)，另用帶橡皮乳頭的1ml滅菌吸管反復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子充分散開。

　　3、用1ml滅菌吸管，吸取上述1∶10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌水的試管內(nèi)，換一支1ml滅菌吸管反復(fù)吹吸5次，制成1∶100稀釋液。

　　4、另取1ml滅菌吸管，吸取上述1∶100稀釋液1ml，注入含有9ml滅水的試管內(nèi)，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管。

　　5、根據(jù)對檢樣污染的情況估計，選擇3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同

　　時，即以吸取該稀釋度的1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做2個平皿。

　　6、用1ml無菌水作空白對照試驗，做2個平皿。?注意：

　�、偌尤霗z樣液時，吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內(nèi)稀釋液，并將吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。

　�、谖�管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時，插入深度要達(dá)2.5cm以上,調(diào)整時應(yīng)使管尖與容器內(nèi)緊貼。

　�、勖窟f增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管。（三）、倒平板

　　稀釋液移入平皿后，及時將涼至46℃的培養(yǎng)基（可放置于46℃水浴保溫）傾注入平皿約15ml，并正反轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。?注意：

　�、倥囵B(yǎng)基不能觸及平皿口邊沿，加入培養(yǎng)基后可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，但不可用力過度，以免濺起觸及上蓋。

　　②檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿，所用時間不宜過長。（四）、培養(yǎng)：

　　待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置25～28℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)5天，從第3天開始觀察后取出，共觀察培養(yǎng)5天。五、菌落計數(shù)及報告：

　　選取菌落數(shù)在10CFU～150CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和酵母數(shù)。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。

　　1）計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計算。

　　2）若所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。

　　3）若所有平板上菌落數(shù)均小于10CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

　　4）若所有稀釋度平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算；如為原液，則以小于1計數(shù)。

　　五、結(jié)果報告