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檢驗(yàn)專業(yè)考試臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)備考知識(shí)
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細(xì)胞因子檢測(cè)概述
一、生物學(xué)檢測(cè)法
生物學(xué)檢測(cè)又稱生物活性檢測(cè)，是根據(jù)細(xì)胞因子特定的生物活性而設(shè)計(jì)的檢測(cè)法。由于各種細(xì)胞因子具有不同的活性，例如IL-2促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，TNF殺傷腫瘤細(xì)胞，CSF刺激造血細(xì)胞集落形成，IFN保護(hù)細(xì)胞免受病毒攻擊，因此選擇某一細(xì)胞因子獨(dú)特的生物活性，即可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。生物活性檢測(cè)法又可分為以下幾類：
1.細(xì)胞增殖法許多細(xì)胞因子具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性，特別是白細(xì)胞介素，如IL-2刺激T細(xì)胞生長(zhǎng)、IL-3刺激肥大細(xì)胞生長(zhǎng)、IL-6刺激漿細(xì)胞生長(zhǎng)等。利用這一特性，現(xiàn)已篩選出一些對(duì)特定細(xì)胞因子起反應(yīng)的細(xì)胞，并建立了只依賴于某種因子的細(xì)胞系，即依賴細(xì)胞株(簡(jiǎn)稱依賴株)。這些依賴株在通常情況下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依賴株CTLL-2在不含IL-2的培養(yǎng)基中很快死亡，而加入IL-2后則可右體外長(zhǎng)期培養(yǎng)。在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞增殖與IL-2量呈正比，因此通過(guò)測(cè)定細(xì)胞增殖情況(如使用3H-TdR摻入法、MTT法等)鑒定IL-2的含量。除依賴株外，還有一些短期培養(yǎng)的細(xì)胞，如胸腺細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、促有絲分裂原刺激后的淋巴母細(xì)胞等，均可作為靶細(xì)胞來(lái)測(cè)定某種細(xì)胞因子活性。
2.靶細(xì)胞殺傷法是根據(jù)某些細(xì)胞因子(如TNF)能在體外殺傷靶細(xì)胞而設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法。通常靶細(xì)胞多選擇體外長(zhǎng)期傳代的腫瘤細(xì)胞株，利用同位素釋放法或染料染色等方法判定細(xì)胞的殺傷率。
3.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的產(chǎn)物分析法某些細(xì)胞因子可刺激特定細(xì)胞產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如IL-2、IL-3誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞合成胺、IL-6誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通過(guò)測(cè)定所誘生的相應(yīng)產(chǎn)物，可反映細(xì)胞因子的活性。
4.細(xì)胞病變抑制法病毒可造成靶細(xì)胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導(dǎo)致的細(xì)胞病變，因此可利用細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)這類因子。
二、免疫學(xué)檢測(cè)法
細(xì)胞因子均為蛋白或多肽，具有較強(qiáng)的抗原性。隨著重組細(xì)胞因子的出現(xiàn)，可較方便地獲得細(xì)胞因子的特異性抗血清或單克隆抗體，因此可利用抗原抗體特異性反應(yīng)的特性，用免疫學(xué)技術(shù)定量檢測(cè)細(xì)胞因子。盡管細(xì)胞因子種類繁多，只要獲得了針對(duì)某一因子的特異性抗體(包括多克隆抗體或單克隆抗體)均可采用相似的技術(shù)開(kāi)展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印跡法。目前，幾乎所有常見(jiàn)細(xì)胞因子的檢測(cè)試劑盒均有商品供應(yīng)。此外還可利用酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞因子單克隆抗體，原位檢測(cè)因子在細(xì)胞內(nèi)的合成及分布情況。免疫學(xué)檢測(cè)法可直接測(cè)定樣品中特定細(xì)胞因子的含量(用ng/ml表示)，為大規(guī)模檢測(cè)臨床病人血清中細(xì)胞因子的含量提供了方便。本法僅測(cè)定細(xì)胞因子的抗原性，與該因子活性不一定相平行，因此要了解細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)，必須結(jié)合生物學(xué)檢測(cè)法。
三、分子生物學(xué)方法
這是一類利用細(xì)胞因子的基因探針檢測(cè)特定細(xì)胞因子基因表達(dá)的技術(shù)。目前所有公認(rèn)的細(xì)胞因子的基因均已克隆化，故能較容易地得到某一細(xì)胞因子的cDNA探針或根據(jù)已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。利用基因探針檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的方法多種多樣，常使用斑點(diǎn)雜交、Northernblot、逆轉(zhuǎn)錄PCR，細(xì)胞或組織原位雜交等。實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵在于制備高質(zhì)量的核酸探針和獲得合格的待測(cè)物(提取的mRNA樣品或細(xì)胞/組織標(biāo)本)。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標(biāo)記物(如生物素、地高辛等)標(biāo)記并與目的基因互補(bǔ)的DNA分子片段或單鏈DNA、RNA.根據(jù)其來(lái)源可分為cDNA探針、寡核核苷酸探針、基因組基因探針及DNA探針等。其中cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針常用于斑點(diǎn)雜交及Northernblot，而RNA探針因穿透性好更適用于原位雜交。核酸探針技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)程序化，以cDNA探針為例主要包括：①質(zhì)粒DNA的提取;②靶DNA分子片段的分離;③靶DNA分子片段標(biāo)記;④待測(cè)樣品mRNA的提取;⑤標(biāo)記cDNA探針對(duì)待檢樣品的雜交;⑥放射自顯影或顯色分析。近年來(lái)出現(xiàn)的RT-PCR檢測(cè)特異性mRNA的方法也廣泛用于細(xì)胞因子研究領(lǐng)域。該法具有靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，甚至從1～10個(gè)細(xì)胞中就可檢出其中的特異mRNA。
巨噬細(xì)胞功能的檢測(cè)
正常小鼠肝中枯否細(xì)胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10%炭粒，據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測(cè)定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。
(二)吞噬功能的檢測(cè)
巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬功能，實(shí)驗(yàn)室常用比細(xì)菌大的細(xì)胞性抗原作為被吞噬顆粒，如雞紅細(xì)胞。其檢測(cè)原理是將受檢細(xì)胞與適量的顆�？乖旌虾�，置37℃保溫0.5～1h，其間時(shí)加振搖，最后離心取測(cè)定細(xì)胞制成涂片，染色鏡檢，分別計(jì)數(shù)出吞噬百分比和吞噬指數(shù)。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自己的條件建立正常參考值。
(三)巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測(cè)定
巨噬細(xì)胞富含溶酶體酶，如酸性磷酸酶、非特異性酯酶、溶菌酶等，測(cè)定這些酶的活性也是衡量巨噬細(xì)胞功能的實(shí)用指標(biāo)之一。
1.酸磷酸酶的測(cè)定
(1)硝酸鉛法：本法優(yōu)點(diǎn)是用普通試劑，價(jià)格便宜，一般實(shí)驗(yàn)室均有條件做，封片后可較長(zhǎng)時(shí)間保存，并可用電子顯微鏡研究觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是細(xì)胞必需固定，而且固定條件要求嚴(yán)格，如處理不當(dāng)酶活性易消失，反應(yīng)步驟也較多。
該法基本原理是在適當(dāng)?shù)拿感詶l件下，巨噬細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶能使β甘油磷酸鈉水解成磷酸鹽后，后者與硝酸鉛反應(yīng)產(chǎn)生磷酸鉛，而磷酸鉛再與硫酸銨反應(yīng)則形成黑色硫化鉛，沉積在胞漿內(nèi)酸所在處，顯示棕黑色顆粒。酶活性強(qiáng)弱可根據(jù)顆粒的數(shù)量和粗細(xì)不同而分級(jí)判斷，顆粒數(shù)量少則細(xì)的為+，顆粒多而粗的為++，顆粒很多且很粗的為+++。
(2)偶氮法：本法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)液中的底物α-萘磷酸鈉被酸性磷酸酶分解后，形成萘酚和磷酸鹽，而萘酚結(jié)構(gòu)中的羥基(-OH)鄰近的活潑碳原子，立即與偶氮染料起反應(yīng)，而產(chǎn)生鮮艷的棕色沉積在酶所在處，缺點(diǎn)是封片后保存時(shí)間短。
2.非特異性酶的測(cè)定該酶比較穩(wěn)定，酶活性喪失較慢，細(xì)胞經(jīng)涂片干燥，置室溫至少可保存半天至一天，因此特別有利于臨床檢驗(yàn)室采用。
常用α-萘醋酸法，該酶可將-萘醋酸分解成萘酚和醋酸，萘酚迅速與偶染料結(jié)合，形成有色反應(yīng)物而沉積。
(四)巨噬細(xì)胞促凝血活性測(cè)定
激活巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37℃預(yù)溫的正常兔血漿和CaC12混合液，加入經(jīng)粘附單層巨噬細(xì)胞的試管中，移置37℃，即時(shí)記錄血漿凝固時(shí)間。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)巨噬細(xì)胞與LPS、腫瘤相關(guān)抗原或HbsAg等溫育后，可見(jiàn)血漿凝固時(shí)間明顯縮短。本法穩(wěn)定方便，也是檢測(cè)不同疾病患者巨噬細(xì)胞功能的指標(biāo)之一。
(五)巨噬細(xì)胞表面受體的檢測(cè)
成熟的巨噬細(xì)胞表面具有Fc受體和C3b受體，這些受體能識(shí)別經(jīng)IgG和C3b調(diào)理的顆粒，并迅速與之結(jié)合，促使細(xì)胞對(duì)相應(yīng)顆粒的吞噬，為此檢測(cè)這些受體可間接判斷巨噬細(xì)胞的功能。常用抗羊紅細(xì)胞致敏的羊紅細(xì)胞懸液作指示物進(jìn)行EA花環(huán)試驗(yàn)，也可用抗原(E)抗體(A)補(bǔ)體(C)復(fù)合物作EAC花環(huán)試驗(yàn)。由于操作繁鎖，現(xiàn)僅供研究用。
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